铜绿假单胞菌是一种临床上常见的医院内的条件致病菌，本研究通过对耐亚胺培南铜绿假单胞菌的耐药分析，了解耐亚胺培南铜绿假单胞菌的耐药机制，以利于临床合理用药。现报道如下。
1 资料与方法
1.1 资料
（1）菌株：收集自2005年1至12月本院VITEK-32仪检出的耐亚胺培南铜绿假单胞菌22株。铜绿假单胞菌标准菌株ATCC 27853一株；（2）药敏纸片：头孢塞肟、头孢曲松、头孢他定、亚胺培南；（3）OprD2基因扩增试剂盒：裂解液A、裂解液B、反应液、耐热酶、阳性模板；（4）其他：9.8%（EDTA·K2+NA2HPO4），无菌生理盐水，M-H平板，血平板等。
1.2 方法
（1）纸片扩散法初筛：将新分离的纯菌种配成0.5McFarland密涂于M-H琼脂平板（Φ70mm）10min后于平板中央贴上EDTA纸片，纸片分2组：1组为头孢塞肟、头孢曲松，在距离EDTA纸片1cm处对称分别贴上头孢塞肟和头孢曲松。另1组为头孢他定、亚胺培南，在距离EDTA纸片1cm处分别贴上头孢他定、亚胺培南。35℃培养24h后观察结果。结果判断：①出现协同现象可能为产金属酶；②不出现协同现象可能为膜通透障碍或既产金属酶又有膜通透障碍；（2）粗提酶（冻融裂解法）将新分离的纯菌种配成0.5McFarland,取50μl于肉汤中35℃培养增菌24h后取1ml于离心管（1.5ml）中，-80℃反复冻融数次，培养无菌生长后于4℃离心机，以10000转/min离心25min，取上清液后-80℃保存待用；（3）改良三维试验[1]： 将铜绿假单胞菌标准株ATCC27853配成0.5McFarland密涂于M-H平板（Φ90mm）待干后于平板中央贴上亚胺培南纸片，距纸片2mm处分别成180°打2个宽1mm、长2cm的槽（标明①②），在①加酶粗提液20μl、②加酶粗提液+EDTA（9：1）35℃培养24h后判断结果
结果判断：①有扩大生长、②抑菌圈光滑完整则为产金属酶；②有扩大生长、①抑菌圈光滑完整则为产金属酶以外的碳青酶烯酶；①、②抑菌圈均光滑完整则为膜通透性障碍；（4）PCR：菌株处理：挑取少许新分离的纯菌种置入内含无菌生理盐水（100μl）的离心管（0.5ml），离心15000rmp5min，弃上清液，加裂解液A 50μl，裂解液B 2μl，混匀后置入55℃保温1h后置入95℃保温5min ，离心10000rpm30 min，上清液即为扩增的模板液。反应体系配制：将反应液管内液体全部移入耐热酶管，以15μl至20小管，实验时将5μl膜板液移入反应体系中并加盖石蜡油2滴即可。热循环参数：95℃预变性2min然后93℃30min→55℃30min→72℃60min共循环35周期，最后一个周期72℃延长至2min。结果观察：取扩增产物10μl与2μl溴酚兰指示剂混匀，点样于2%琼脂糖凝胶中，以100v电压电泳20～30min，出现与阳性膜板分子量相同的条带（193bp）即为阳性。
2 结果
2.1 表型初筛结果
22株铜绿假单胞菌中有10株产生协同现象占45.4%。
2.2 改良三维试验结果
22株铜绿假单胞菌中有5株产金属酶占22.7%。
2.3PCR结果
22株铜绿假单胞菌中有4株为OprD缺失，即由膜通透障碍引起占18.8%。
2.4 22株铜绿假单胞菌抗菌药物敏感性统计见表1。表1 22株铜绿假单胞菌的抗菌药物敏感性统计 （略）
3 讨论
亚胺培南是一种新型的β-内酰胺类抗生素，属碳青酶烯类，具有较好的抗菌活性，且对β-内酰胺酶稳定[2]，是治疗假单胞菌感染活性最强的药物之一，但随着临床的广泛使用，耐亚胺培南菌株开始出现并日益增多，严重限制了亚胺培南的应用。铜绿假单胞菌对亚胺培南耐药常不是由单一因素造成的，目前认为造成本菌耐亚胺培南的已知主要原因有4种，即（1）产生β内酰胺酶：据Pai 等报道部分菌株可能产β-类酰胺酶[3]，本实验中由于产金属酶而耐药的菌株为5株（22.7%）；（2）膜通透性障碍：即其外层细胞壁的外膜蛋白D2是碳青霉烯类抗生素进入的通道，失去特异性外膜蛋白D2导致药物不能进入细菌体内，Statake等[4]认为患者接受过其他内酰胺类药物抗感染治疗后，会诱导铜绿假单胞菌失去其膜蛋白通道oprD2，从而对亚胺培南形成耐药，本实验OprD2基因扩增结果显示：22株铜绿假单胞菌中有4株菌株表现为OprD2缺失（18.8%）；（3）细胞外膜主动外排系统的表达；（4）青霉素结合蛋白的改变：本实验未涉及3、4点，在此也作详叙述。以上可见碳青霉烯类抗生素耐药机制的复杂性。因此，在治疗铜绿假单胞菌引起的疾病时，建议在临床上选择抗菌药物时以细菌培养为前提，药敏实验结果为依据，合理选择敏感的药物治疗方案[5]，防止耐药菌株的出现和传播。
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